Zwierzęta dające nadzieję

Zwierzęta dające nadzieję

Oleg Makarov
"Popular Mechanics" №4, 2016

Jedną z najgorszych chorób, jakie przyroda daje ludziom, jest genetyka. Możesz z powodzeniem radzić sobie z czynnikami wywołującymi choroby – bakteriami i wirusami, ale jeśli problem dotyczy ludzkiego genomu od urodzenia, niezwykle trudno jest pomóc pacjentowi. Współczesna nauka uparcie poszukuje okazji do "naprawy" zmutowanych genów.

Miodystrofia Duchenne'a jest jedną z nieczęstych, ale wciąż stosunkowo powszechnych chorób genetycznych. Choroba jest diagnozowana w wieku od trzech do pięciu lat, zwykle u chłopców, objawiająca się początkowo tylko w zatkanych ruchach, do wieku dziesięciu lat cierpiących na taką miodystrofię nie może już chodzić, do 20-22 lat jego życie się kończy. Jest to spowodowane mutacją genu dystrofiny, która znajduje się na chromosomie X. Koduje białko łączące błonę komórki mięśniowej z kurczliwymi włóknami. Funkcjonalnie jest rodzajem sprężyny, która zapewnia płynną redukcję i integralność błony komórkowej. Mutacje w genie prowadzą do dystrofii tkanki mięśniowej szkieletu, przepony i serca. Leczenie choroby jest paliatywne i pozwala tylkozłagodzić cierpienie. Jednak wraz z rozwojem inżynierii genetycznej na końcu tunelu pojawiło się światło.

O wojnie i pokoju

Terapia genowa polega na dostarczaniu konstrukcji opartych na kwasach nukleinowych do komórek w celu leczenia chorób genetycznych. Za pomocą tej terapii można rozwiązać problem genetyczny na poziomie DNA i RNA, zmieniając proces ekspresji pożądanego białka. Na przykład, DNA można dostarczać do komórki o skorygowanej sekwencji, z którą syntetyzuje się funkcjonalne białko. Albo, przeciwnie, możliwe są delecje niektórych sekwencji genetycznych, co również pomoże zmniejszyć szkodliwe skutki mutacji. Teoretycznie jest to proste, ale w praktyce terapia genowa oparta jest na najbardziej złożonych technologiach pracy z obiektami mikroświata i stanowi połączenie zaawansowanej wiedzy z zakresu biologii molekularnej.

"Gen dystrofiny, którego mutacje wytwarzają miodystrofię Duchenne'a, jest ogromny" – mówi dyrektor ds. Rozwoju firmy biotechnologicznej Marlin Biotech, Ph.D. w dziedzinie biologii Vadim Zhernovkov. w powieści "Wojna i pokój".I wyobraźmy sobie, że wyciągnęliśmy z eposu ważne strony. Jeśli na tych stronach opisane są znaczące zdarzenia, zrozumienie tej książki byłoby już trudne. Ale gen jest bardziej skomplikowany. Znalezienie kolejnej kopii wojny i pokoju jest łatwe, a następnie można odczytać brakujące strony. Ale gen dystrofiny znajduje się w chromosomie X, a u mężczyzn jest sam. Tak więc, w chromosomach płciowych u chłopców, tylko jedna kopia genu jest przechowywana po urodzeniu. Nie ma innego miejsca.

Wreszcie, podczas syntezy białka z RNA, ważne jest zachowanie ramki odczytu. Ramka odczytu określa, która grupa trzech nukleotydów jest odczytywana jako kodon, co odpowiada jednemu aminokwasowi w białku. Jeśli występuje delecja w genie fragmentu DNA, który nie jest wielokrotnością trzech nukleotydów, następuje przesunięcie ramki odczytu – kodowanie ulega zmianie. Można to porównać do sytuacji, w której, po rozdartych stronach, w całej pozostałej książce wszystkie litery zostaną zastąpione kolejnymi w kolejności alfabetycznej. Zrób bełkot. To samo dotyczy nieprawidłowo zsyntetyzowanego białka ".

Tynk biomolekularny

Jedną ze skutecznych metod terapii genowej do przywracania prawidłowej syntezy białek jest pomijanie eksonów za pomocą krótkich sekwencji nukleotydowych.W Marlin Biotech technologia pracy z genem dystrofiny została już opracowana przy użyciu tej metody. Jak wiadomo, w procesie transkrypcji (syntezy RNA) najpierw formuje się tak zwane RNA prematrix, zawierające zarówno regiony kodujące białka (eksony), jak i niekodujące (introny). Następnie rozpoczyna się proces splicingu, podczas którego introny i eksony są rozdzielane i powstaje "dojrzały" RNA, składający się tylko z eksonów. W tym momencie niektóre egzony mogą zostać zablokowane, "zakryte" za pomocą specjalnych cząsteczek. W rezultacie w dojrzałym RNA nie będzie tych regionów kodujących, które chcielibyśmy się pozbyć, a zatem ramka odczytu zostanie przywrócona, białko zostanie zsyntetyzowane.

"Rozwinęliśmy tę technologię. in vitro– mówi Vadim Zhernovkov, – to znaczy na hodowlach komórkowych wyhodowanych z komórek pacjentów z miodystrofią Duchenne'a. Ale poszczególne komórki nie są organizmem. Podczas inwazji procesów komórkowych musimy obserwować efekty na żywo, ale nie jest możliwe zaangażowanie ludzi w testowanie z różnych powodów, od etycznego po organizacyjny. Dlatego konieczne stało się uzyskanie modelu miodystrofii Duchenne'a z pewnymi mutacjami opartymi na zwierzęciu laboratoryjnym. "

Jak ukłuć mikroświat

Transgeniczne myszy umożliwiają tworzenie żywych modeli poważnych ludzkich chorób genetycznych. Ludzie powinni być wdzięczni tym małym stworzeniom.

Zwierzęta transgeniczne to zwierzęta uzyskane w laboratorium, w genomie których zmiany zostały celowo i celowo wykonane. W latach 70. ubiegłego wieku stało się jasne, że tworzenie transgenów jest najważniejszą metodą badania funkcji genów i białek. Jedną z najwcześniejszych metod uzyskiwania całkowicie zmodyfikowanego genetycznie organizmu było wstrzyknięcie DNA do przedjądrza ("prekursor jądra") zygot zapłodnionych jaj. Jest to logiczne, ponieważ najłatwiej jest zmodyfikować genom zwierzęcia na samym początku jego rozwoju.

Jubilerzy są zazdrośni. Wstrzykiwanie DNA do zygoty pronukleusowej jest jedną z najwcześniejszych i najbardziej tradycyjnych technologii transgenicznych. Wstrzyknięcie wykonuje się ręcznie przy użyciu ultracienkich igieł pod mikroskopem z 400-krotnym powiększeniem

Wstrzyknięcie do rdzenia zygoty jest bardzo nietrywialną procedurą, ponieważ mówimy o mikroskali. Mysia komórka jajowa ma średnicę 100 μm, a przedjądrza 20 μm. Operacja odbywa się pod mikroskopem z 400-krotnym powiększeniem, ale wstrzyknięcie jest najbardziej ręczną operacją.Oczywiście, do "wstrzyknięcia" używa się nie tradycyjnej strzykawki, ale specjalnej szklanej igły z wydrążonym kanałem wewnątrz, gdzie zbierany jest materiał genowy. Jeden koniec może być trzymany w dłoni, a drugi – bardzo cienki i ostry – praktycznie niewidoczny gołym okiem. Oczywiście, tak delikatna konstrukcja szkła borokrzemianowego nie może być przechowywana przez długi czas, dlatego do laboratorium jest zestaw półfabrykatów, które są wyciągane na specjalnej maszynie tuż przed pracą. Zastosowano specjalny system obrazowania kontrastowego komórki bez barwienia – interakcja z samcem przedjądrzyowym jest traumatyczna i jest czynnikiem ryzyka przeżycia komórki. Farba byłaby kolejnym takim czynnikiem. Na szczęście jaja są dość uporczywe, ale liczba zygot, które dają zwierzęta transgeniczne, stanowi zaledwie kilka procent całkowitej liczby jaj, w których dokonano iniekcji DNA.

Następny etap jest chirurgiczny. Operacja jest przeprowadzana na przeszczepie zygoty z mikroiniekcją do leja jajowodu myszy biorcy, która stanie się zastępczą matką przyszłego transgenu.Następnie zwierzę laboratoryjne przechodzi naturalnie cykl ciąży i rodzą się potomstwo. Zazwyczaj w miocie jest około 20% transgenicznych myszy, co również wskazuje na niedoskonałość metody, ponieważ zawiera duży element przypadku. Po wstrzyknięciu badacz nie może kontrolować, w jaki sposób wstawione fragmenty DNA będą się integrować z genomem przyszłego organizmu. Istnieje duże prawdopodobieństwo takich kombinacji, które doprowadzą do śmierci zwierzęcia na etapie embrionalnym. Niemniej jednak metoda działa i jest odpowiednia do wielu celów naukowych.

Nożyczki DNA

Ale jest bardziej skuteczny sposób oparty na ukierunkowanej edycji genomu przy użyciu technologii CRISPR / Cas9. "Dzisiaj biologia molekularna przypomina nieco epokę dalekich wypraw morskich pod żaglami", mówi Vadim Zhernovkov. "Niemal co roku w tej nauce, która może zmienić nasze życie, pojawiają się znaczące odkrycia, na przykład kilka lat temu odkryli mikrobiolodzy badane gatunki bakterii są odporne na infekcje wirusowe W wyniku dalszych badań okazało się, że bakteryjny DNA zawiera określone loci (CRISPR),z których syntetyzowane są fragmenty RNA, które mogą komplementarnie wiązać się z kwasami nukleinowymi obcych pierwiastków, na przykład DNA lub RNA wirusów. Cas9, nukleaza enzymu, wiąże się z tym RNA. RNA służy jako przewodnik Cas9, który oznacza specyficzny region DNA, w którym nukleaza dokonuje cięcia. Około trzech do pięciu lat temu pojawiły się pierwsze artykuły naukowe, w których opracowano technologię CRISPR / Cas9 do edycji genomu. "

Protein-cutter. Diagram pokazuje proces CRISPR / Cas9, który obejmuje subgenomowe RNA (sgRNA), jego sekcja działa jako przewodnik RNA, a także nukleaza białkowa Cas9, która przecina obie nici genomowego DNA we wskazanym przewodniku RNA.

W porównaniu do metody wprowadzania konstruktu do losowej insercji, nowa metoda umożliwia wybranie elementów systemu CRISPR / Cas9 w taki sposób, aby precyzyjnie kierować przewodniki RNA do właściwych części genomu i osiągnąć docelową delecję lub wstawienie pożądanej sekwencji DNA. Błędy są również możliwe w tej metodzie (przewodnik RNA czasami nie jest połączony z regionem, do którego jest skierowany), jednak przy użyciu CRISPR / Cas9, wydajność tworzenia transgenu wynosi już około 80%."Ta metoda ma szerokie perspektywy, a nie tylko do tworzenia transgenów, ale także w innych obszarach, w szczególności w terapii genowej", mówi Vadim Zhernovkov. "Technologia jest jednak dopiero na początku i wyobraź sobie, że w najbliższej przyszłości Kod osoby będzie dość trudny w CRISPR / Cas 9. Dopóki istnieje możliwość błędu, istnieje niebezpieczeństwo, że dana osoba straci ważną część kodującą genomu. "

Medycyna mleczna

Rozwój technologii transgenicznych umożliwia produkcję białek zwierzęcych wymaganych przez przemysł farmaceutyczny. Te białka są ekstrahowane z mleka transgenicznych kóz i krów. Istnieją również technologie do pozyskiwania konkretnych białek z jaj kurzych.

Rosyjska firma Marlene Biotech stworzyła transgeniczną mysz, w której mutacja prowadząca do miodystrofii Duchenne'a została w pełni odtworzona, a następnym krokiem będzie testowanie technologii terapii genowej. Jednak tworzenie modeli ludzkich chorób genetycznych opartych na zwierzętach laboratoryjnych nie jest jedynym możliwym zastosowaniem transgenów. Tak więc w Rosji i zachodnich laboratoriach trwają prace w dziedzinie biotechnologii, które umożliwiają uzyskanie białek leczniczych pochodzenia zwierzęcego ważnych dla przemysłu farmaceutycznego.Jako producenci można stosować krowy lub kozy, w których można zmienić aparat komórkowy do produkcji białek zawartych w mleku. Białko lecznicze można wyekstrahować z mleka, które uzyskuje się nie za pomocą środków chemicznych, ale za pomocą naturalnego mechanizmu, który zwiększy skuteczność leku. Obecnie opracowano technologie wytwarzania takich białek leczniczych, jak ludzka laktoferyna, prourokinaza, lizozym, atryna, antytrombina i inne.


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: