Wyniki pierwszej dekady badania CRISPR zostały podsumowane • Elena Naimark • Wiadomości naukowe na temat "elementów" • Biologia molekularna, mikrobiologia, genetyka

Wyniki pierwszej dekady badania CRISPR

Ryc. 1. Bakteria Streptococcus thermophilus, na podstawie którego dowiedziono istnienia nabytej odporności prokariontów po raz pierwszy, a jego mechanizm został zdemontowany. Zdjęcia z mysticalbiotech.com

10 lat temu opublikowany został artykuł grupy badawczej Danisco firmy spożywczej Danisco, w którym wykazano obecność nabytej odporności u prokariontów i wykazano jej działanie w oparciu o transkrypty CRISPR. W tej dekadzie nabyta odporność bakterii i archeonów z kategorii egzotycznych zjawisk w świecie drobnoustrojów przeszła do kategorii ich nieodłącznych właściwości. Badania wykazały, w jaki sposób mogło powstać w toku ewolucji, jaka jest różnorodność narzędzi molekularnych w odporności CRISPR i, co najważniejsze, w jaki sposób można z niej korzystać. Potencjał mikrobiologicznego i terapeutycznego wykorzystania instrumentów molekularnych CRISPR jest naprawdę olbrzymi, chociaż ostatnie prace wskazują, że wymagają poprawy w celach klinicznych.

10 lat temu Rodolphe Barrangu (Rodolphe Barrangou) i Philip Horvath (Philippe Horvath) i jego koledzy odkryli, że system CRISPR w prokariotów jest związany z nabyciem odporności (zob. R. Barrangou et al, 2007. CRISPR Zapewnia oporność nabyta przed wirusami w prokariotów). 10 lat to bardzo krótki czas dla nauki, ale dość duży czas na burzliwą rewolucyjną zasadę.Z okazji okrągłej daty Barranga i Horvath, którzy zainaugurowali tę rewolucję, opublikowali w czasopiśmie Mikrobilogia natury przegląd historii badań CRISPR.

Przypomnijmy, że system CRISPR to seria palindromicznych powtórzeń, między którymi są krótkie segmenty wirusowego DNA – tak zwane elementy dystansowe. Ten system musi również zawierać cas-geny (cas oznacza CRISPR-related – "related with CRISPR"). Cały system zaprojektowano tak, aby rozpoznawał obcą sekwencję nukleotydową i ją naprawiał. Następnie nożyczki nukleazowe (endonukleazy wchodzące do Cas lub w inny sposób, na przykład RNazy) wchodzą do cięcia wirusowego DNA. Wróg staje się nieszkodliwy. Ale to nie wystarczy: w przypadku bakterii, która przeżyła atak wirusowy, nowe segmenty palindromiczne z wirusowymi odstępnikami są dodawane na początku kasety (patrz kaseta Gene). Teraz fragment DNA pokonanego wroga zostaje włożony do genomu bakterii i zostanie przeniesiony na potomków bakterii. Dokładnie tak zorganizowana jest nabyta odporność w bakteriach i archeonach. Jest stale aktualizowany, ponieważ komórka bakterii napotyka na infekcje wirusowe.

Pod koniec lat 80. pojawiły się pierwsze doniesienia o obecności bakterii w genomach (Escherichia coli, prątek gruźlicy,jak również niektóre cyjanobakterie) i archiwa serii powtórzeń palindromowych z krótkimi wstawkami między nimi. Jakie rodzaje powtórzeń i dlaczego są potrzebne, były całkowicie niejasne. Postrzegano je jedynie jako przeszkodę w zestawianiu fragmentów genomu. W latach 90., kiedy genomy bakterii zaczęły masowo sekwencjonować ("czytać"), okazało się, że powtórzenia nie są egzotycznym elementem DNA poszczególnych bakterii i archeonów, ale bardzo powszechnym składnikiem ich genomów.

W 2002 r. Powtórzenia te nazywane były CRISPR, co w przeciwieństwie do poprzednich propozycji (DVR – bezpośrednie powtórzenia zmiennych, TREP – powtórzenia tandemowe, LTRR – długie tandemowe powtarzające się sekwencje powtórzeń, SRSR – krótkie regularne odstępy powtórzone, LCTR – duże skupienia powtórzeń tandemowych , SPIDR – spacer przeplatane bezpośrednie powtórzenia), utknął w nauce. Ale funkcja tych powtórzeń pozostała niejasna, aż w 2005 roku ukazały się prace (jednocześnie trzy artykuły z różnych grup naukowych), w których stwierdzono, że spacery przypominają fragmenty sekwencji wirusowych lub plazmidowych. I nie tylko, ale te, z którymi borykają się badane populacje bakterii. Dlatego, jak sugerowano w tych artykułach, wpływ systemów CRISPR może być nieco podobny do interferencji RNA (supresja ekspresji genów na etapach transkrypcji, translacji lub degradacji mRNA), chociaż nie ma instrumentalnych analogów interferencji RNA wśród cas– brak przedmiotów.

Następnie podjęto prace grupy naukowej przemysłowego przedsiębiorstwa spożywczego Danisco, które zajmowało się w szczególności bakteriami do produkcji produktów kwasu mlekowego. Użyli sekwencji CRISPR do rozróżnienia szczepów bakterii Streptococcus thermophilus (Ryc. 1), które są używane do produkcji jogurtu. (Jest oczywiste, że CRISPR powinien być wysoce swoisty dla szczepów.) Gdy dane CRISPR były wystarczające, poddano je analizie skupień. I nagle okazało się, że powstałe skupienia palindromowych powtórzeń są skorelowane z opornością na różne infekcje wirusowe! Co ważniejsze, dodatkowe elementy dystansujące z segmentami palindromowymi znajdują się w bakteriach, które przeszły atak wirusowy. We wczesnych latach 2000-tych stosowano już szczepy odporne na lityczne fagi. Po porównaniu szczepów, które były używane w przemyśle w latach 80. i 90. XX wieku, z ich odpornymi potomkami z lat 2000, stało się jasne, co dokładnie zapewnia odporność na infekcje. Rozwinięto zagadkę: separatory CRISPR określiły odporność szczepów bakteryjnych po infekcji.

Zespół Danisco przetestował to założenie w serii eksperymentów: szczepy traktowano znanymi fagami, a następnie dopasowywanosekwencje nukleotydowe ich genomów. Ponadto próbowali włączać i wyłączać różne geny, w tym cas. I okazało się, że rzeczywiście do kaset CRISPR dodawane są nowe palindromy z wirusowymi przekładkami, casgeny biorą udział w tworzeniu nowych stron CRISPR. Są (w szczególności cas9) są niezbędne do rozpoznawania i neutralizacji czynników wirusowych. Główni uczestnicy nabytej odporności zajęli etap – palindromy, wirusowe spacery i szereg genów cas; przedstawił portret systemu CRISPR-Cas, który zapewnia nabytą odporność bakterii (patrz R. Barrangou i wsp., 2007. CRISPR zapewnia zatwierdzenie).

Należy zauważyć, że chociaż hipoteza o hamowaniu wirusowego DNA przez rodzaj interferencji RNA została przedstawiona w 2006 roku (patrz KS Makarova i wsp., 2006). , analogie funkcjonalne z eukariotycznymi RNAi i hipotetyczne mechanizmy działania), masowa praca nad badaniem tego zjawiska rozpoczęła się dopiero po 2007 r. (ryc. 2). Ważne było nie tylko postawienie skutecznej hipotezy, ale udowodnienie realności zjawiska i określenie jego "kół i narzędzi". Wtedy istnieje możliwość ukierunkowanych znaczących badań. I nie wolno im było iść za nimi. Co więcej, poczucie nabytej odporności wstrząsnęło światem naukowym: dziedzictwem Lamarckiego w świecieprokaryotes! ewolucyjny wyścig zbrojeń w bakteriach i fagach! bakterie mają specjalny mechanizm ochrony przed obcym DNA przez rodzaj ingerencji w eukariota! Fajnie!

Ryc. 2 Historia badań CRISPR podzielona jest na cztery okresy: "Antyk" (1990-2000), "Średniowiecze" (2000-2007), "Nowa historia" (2007-2013) i teraźniejszość. Przedstawiono chronologię najważniejszych prac w tym obszarze (liczby – odniesienia do tych prac, jak podano w oryginalnym artykule R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i zastosowania CRISPR

Wkrótce odkryto podobny mechanizm. E. coli. I dla Streptococcus thermophilus dodatkowy warunek jest otwarty na rozpoznanie docelowej sekwencji wirusowej: konieczne jest, aby był poprzedzony specjalnym zestawem nukleotydów. Otrzymał nazwę PAM (sąsiedni motyw protospacera, czyli zestaw nukleotydów, leżący przed proto-odkrywcą). Ujawniono także funkcję Cas9: jest to endonukleaza, która przecina DNA, wycofując dokładnie 3 nukleotydy po protopacerze. Następnie pojawiły się doniesienia o innym zapotrzebowaniu na system rozpoznawania CRISPR docelowej sekwencji wirusowej, tzw. TracrRNA (tracrRNA, transaktywowane przez trans CRISPR RNA; patrz Odebrana odporność od bakterii może być związana z mechanizmami interferencji RNA, "Elements", 6 kwietnia 2011 r. ).TracrRNA to sekwencja 25 nukleotydów, komplementarna do segmentu palindromowego i położona na przeciwległej nici DNA z CRISPR. Dlatego dostała przedrostek "trans" w nazwie.

Gdy RNA jest odczytywane z sekwencji CRISPR, uzyskuje się długi, niedojrzały pre-mRNA o 511 nukleotydach. Najpierw musi zostać pocięte na "właściwe" fragmenty dystansu palindromowego – tzw. CrRNA (CRISPR RNA). Tutaj włącza się tracrRNA, dołączając do palindromu i tworząc krótkie podwójne nici. W tej formie uczestnicy systemu CRISPR mogą się tego nauczyć (Сas9, Сsn1, RNazIII). Pojawienie się na pośrednim etapie dojrzewania podwójnej nici RNA wzmacnia podobieństwo do interferencji RNA: tworzy on również kompleks dwóch komplementarnych sparowanych nici RNA, które Dicer może rozpoznać i pociąć długą nić na krótkie fragmenty 25 nukleotydów.

W kolejnych latach naukowcy pokazali, jak zróżnicowany jest system CRISPR w organizmach prokariotycznych. Jak zwykle, po kumulacji danych dotyczących różnorodności elementów składowych pojawiają się klasyfikacje. Systemy CRISPR są teraz podzielone na kilka klas, typów i podtypów, skupiając się na różnicy w funkcjonalnych elementach Сas i docelowym systemie rozpoznawania DNA lub RNA.Chociaż zasada nabytej odporności jest taka sama dla wszystkich organizmów prokariotycznych – ten system jest kodowany w DNA, mający na celu rozpoznanie fragmentów obcego DNA lub RNA przy użyciu RNA i zniszczenie ich endonukleazami – istnieje wiele odmian.

Istnieją dwie klasy CRISPR (ryc. 3): w pierwszym głównym efektorem (aktywnym czynnikiem) jest kompleks białkowy Kaskada (kompleks związany z CRISPR do obrony przeciwwirusowej) i endonukleaza Cas3, w drugim – Kaskada jest nieobecna, a działa endonukleaza Cas9. W obu klasach są koniecznie białka Сas1 i Сas2, dlatego nie biorą udziału w klasyfikacji. Te białka, jak się okazało, uzupełniają nowe fragmenty palindromowego separatora na początku kasety CRISPR.

Ryc. 3 Schemat systemów CRISPR i ich klasyfikacja w oparciu o różnice w Cas i cząsteczkach docelowych (DNA lub RNA). Obraz z R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i aplikacje CRISPR

Rozróżnienie między endonukleazami jest podstawą do rozróżniania typów w klasach. Typ 1 to endonukleaza Cas3, która przecina jedną z podwójnych nici wirusowego DNA. Typ 2 to Cas9, który tnie oba podwójne nici DNA. Typ 3 – Cas10 (w niektórych miejscach wycina docelowe RNA). Typ 4 – Csf1 (niszczy podwójne DNA, ale jeszcze nie wiadomo, jak to zrobić). Typ 5 charakteryzuje się Cas12, który tworzy dwa cięcia w podwójnej nici DNA.Typ 6 – Cas13 ("rozpada się" z jednoniciowego matrycowego RNA na wiele małych kawałków). PAM są zaangażowane w działanie systemów typu 1, 2, 5 i 6 (na rysunku 3 są one oznaczone gwiazdkami). Każdy z tych 6 typów ma swoje własne podziały: teraz istnieje 19 podtypów. Około 90% archeonów i 40% bakterii w takiej czy innej formie posiada ochronę CRISPR przed fagami i obcymi elementami mobilnymi.

Badania cas pozwolił na rekonstrukcję możliwej ewolucji systemów CRISPR. Zakłada się, że pojawiły się one jako pochodne enzymów, które wiedziały, jak wycinać i szyć ruchome elementy do sekwencji nukleotydów. Okazało się, kiedy rozważali możliwych przodków. cas1. Przodkowie tego białka nie są związani z CRISPR, ale są zaangażowani w precyzyjne wycinanie i wklejanie transpozonów. Rodzina tych pradawnych białek nazywana jest kasponem (patrz M. Krupovic i wsp., 2015. Casposons: nowa nadrodzina samo-syntetyzującej odporności CRISPR-Cas). Oczywiste jest, że znaczenie wycinania i wklejania transpozonów jest podobne do wycinania i wklejania nowych przekładek. Dlatego podobny zestaw narzędzi jest odpowiedni dla obu działań – Cas1 i jego zmodyfikowanych pochodnych. Co więcej, caspozone ma końcową sekwencję powtórzeń, które można łatwo przekształcić i specjalizować w palindromy CRISPR.

Potężna ochrona bakterii i archeonów w postaci odziedziczonej odporności na CRISPR powstała w wyniku wyścigu zbrojeń żywiciela i pasożyta. Bakterie opracowały coraz bardziej wyrafinowany system ochrony, a wirusy opracowywały coraz bardziej wyrafinowane sposoby na obejście tej ochrony. Bardzo trudno jest wirusom pokonać ochronę CRISPR w populacji bakterii, ponieważ różne komórki bakterii mają inny zestaw spacerów. Dlatego fag, nawet zmieniając sekwencje na jednym lub dwóch docelowych stronach (protopacers) i radząc sobie z jednym lub dwoma crRNA, nie może jednocześnie zmienić całego zestawu stron protopacener. Jak wykazały badania, jeśli populacja bakterii jest co najmniej nieco zróżnicowana, atak wirusa jest fiaskiem (patrz Naukowcy odkryli, dlaczego bakteriofagi nie są w stanie zwalczyć bakteryjnego układu odpornościowego, Elements, 18 kwietnia 2016 r.). Dlatego wyścig zbrojeń doprowadził do tego, że wirusy podjęły inną drogę, "próbując" zorganizować wspólny system przeciwdziałania CRISPR. Polega na syntezie małych białek (ich sekwencje są kodowane w wirusowym DNA), które hamują białka Cas, w tym Cas9 (patrz A. Pawluk i wsp., 2016. Naturalnie występujące wyłączniki dla CRISPR-Cas9).Z punktu widzenia wirusa jest to bardzo konstruktywne rozwiązanie.

W 2011 r. Opublikowano prace, które potwierdziły możliwość przeniesienia CRISPR z jednej bakterii do drugiej (patrz R.Sapranauskas i in., 2011). Streptococcus thermophilus System CRISPR / Cas zapewnia odporność w Escherichia coli). To otworzyło naprawdę ogromne możliwości wykorzystania systemu CRISPR-Cas. To tutaj rozpoczął się pomysł edycji genomu za pomocą tego zestawu narzędzi. W końcu, jeśli myślisz o molekularnych nożycach, które mogą niezależnie znaleźć miejsce wymyślone przez badacza i wyciąć dokładnie tam, gdzie jest to wymagane. Aby to zrobić, należy dołączyć nożyczki do nicieni do sekwencji RNA za pomocą elementu dystansowego i palindromu, który zostanie wycięty tam, gdzie zamierzał badacz – z dwóch końców fragmentu docelowego lub z jednego. I za te dokładnie te nożyczki do wykorzystania – wiele opcji. Oto niektóre z nich.

Metody genotypowania klonów bakteryjnych i konsorcjów wzdłuż unikalnego zestawu elementów dystansowych zostały znacznie ulepszone. To rozpoczęło stosowanie CRISPR w przemyśle spożywczym. Teraz możliwe jest nie tylko wybranie pożądanego odkształcenia przez sekwencję spacerów, ale także określenie kolejności jego spotkań z czynnikami fagowymi, ponieważ sekwencja spacerów CRISPR odzwierciedla historię tych spotkań (ryc. 4).

Ryc. 4 Takie klastry można uzyskać przez badanie sekwencji CRISPR w różnych szczepach: szczepy z tymi samymi kasetami są zgrupowane razem (klaster 1); w drugiej grupie pojawią się szczepy z dodatkowymi wstawkami umieszczonymi na początku kasety (oznaczają ostatnie ataki wirusów u szczepów potomnych) (klaster 2); będą grupy z unikalnymi zestawami spacerów, które wskażą na oddzielną historię badanych szczepów (klastry 3, 4, 5). Obraz z R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i aplikacje CRISPR

Możesz tworzyć od nowa lub zwiększać odporność szczepów bakteryjnych na różne fagi. Stabilność w tym przypadku oznacza dokładne rozpoznanie wroga i jego neutralizację (istnieją inne sposoby na stworzenie stabilności – na przykład postawienie bariery, aby wciągnąć wroga do wnętrza komórki). Aby stworzyć odporny szczep, konieczne jest wprowadzenie zsyntetyzowanego układu RNA / DNA do komórek.cas. Ponadto, bakteria nieuchronnie osadzi wirusowy fragment w kasecie CRISPR i uzyska wymaganą oporność. W przypadku szczepów przemysłowych taka odporność nie zaszkodzi zbytnio. Coś jak szczepienie. Lub w taki sam sposób, aby zorganizować ciągłą wrażliwość na antybiotyki dla szczepu doświadczalnego.Wiadomo, że bakterie z reguły szybko rozwijają oporność na antybiotyki. Jednak rozwój oporności można spowolnić: w tym celu należy umieścić barierę CRISPR dla plazmidów niosących elementy genetyczne oporności (ryc. 5).

Ryc. 5 Mechanizm do wywoływania odporności na fagi lub elementy ruchome dzięki sztucznie wprowadzonym podkładkom dystansowym. Obraz z Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i aplikacje CRISPR

W związku z tym ważne jest, aby system ochrony działał nie tylko w komórkach prokariotycznych, ale także w eukariotach. Oczywiście komórka eukariotyczna nie jest w stanie umieścić w genomie spacera z palindromem, ale działająca wersja crRNA-casgdzie RNA jest komplementarny do sekwencji docelowej w genomie wirusa, będzie bardzo pomocne. W ten sposób efekt crRNA-został przetestowany z dużym sukcesem.cas przeciwko HIV. Naukowcy pracowali z kulturami komórkowymi zainfekowanymi tym wirusem. Traktując je crRNA-cas, które przenosiło spacer z HIV, pozbywają się komórek infekcji (patrz W. Hu et al., 2014.). CrRNA znalazł wirusowe miejsca wstawione do genomu komórki i za pomocą Cas9 zneutralizował je. W tym przypadku identyfikacja i przecięcie sekwencji były niezwykle dokładne, nie było "żadnych" niezbędnych fragmentów komórkowego DNA.To dobrze wróży znalezieniu lekarstwa na HIV.

A jeśli szczep jest traktowany faga, którego DNA jest sztucznie wprowadzane do fragmentów CRISPR z odstępnikami z genomu tego szczepu, wtedy bakterie zaczną się niszczyć. Ponieważ bakteryjna maszyna transkrypcyjna nieuchronnie odczyta crRNA z jego własnymi fragmentami, a oni znajdą uzupełnienia na swoim genomie bakteryjnym i pokroją je własnymi nukleazami (ryc. 6). Taki jest schemat ochrony antybakteryjnej.

Ryc. 6 Infekcja fagami niosącymi elementy genomu drobnoustrojów w kasetach CRISPR i aktywacja tego systemu prowadzi do samozniszczenia bakterii. Obraz z R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i aplikacje CRISPR

System CRISPR można przystosować do edycji genomu lub do zatrzymania odczytu poszczególnych genów. W pierwszym przypadku konieczne będzie dodanie do CRISPR enzymów naprawczych (patrz reparacja DNA). Następnie crRNA w odpowiednim miejscu dołączy do sekwencji DNA, endonukleazy go pokrojone, a naprawy białek zakończą prawidłową sekwencję (ryc. 7). Może to być przydatne do wyszukiwania i edycji poszczególnych mutacji. W przypadku zahamowania transkrypcji, crRNA właśnie zajmuje właściwe miejsce,Polimeraza RNA jest zablokowana, a odczyt zatrzymany. Do takich celów stosuje się zmutowany Cas9, którego łańcuch DNA nie nacina.

Ryc. 7 Edycja, a także hamowanie transkrypcji w komórkach bakterii: możesz edytować mutację poprzez wstawienie CRISPR ze zmutowanym dystansem do genomu faga; crRNA ze zmutowanym dystansem są następnie rozważane, miejsce w genomie bakteryjnym zostanie znalezione i zredagowane przez białka naprawcze; jeśli w konstrukcie użyto genu cas9 z mutantem nykaza (zmcas9), wtedy właściwe miejsce zostanie znalezione, ale po tym, jak system zostanie po prostu zablokowany. Obraz z R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Dekada odkrycia: funkcje i aplikacje CRISPR

Aby pracować z komórkami eukariotycznymi, skonstruowano konstrukt z białek crRNA i Cas, które działają z eukariotycznym DNA. Nie jest nawet konieczne umieszczanie wirusów CRISPR-cas w komórce. Jeśli wiązka cząsteczek crRNA z docelowym fragmentem i pożądanym Cas wchodzi do komórki, wówczas crRNA łączy się z sekwencją DNA, nukleazy będą ostrożnie wycinać pożądany fragment, a białka naprawy ponownie uzupełnią skorygowaną sekwencję, stosując komplementarną macierz. Taką pracę wykonywano, na przykład, w celu korekcji wzroku u szczurów z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki (patrz W.-H. Wu i wsp., 2016.Wykryto naprawę CRISPR (przedkliniczny model retinitis pigmentosa).

Zapalenie siatkówki jest chorobą, w której upośledzone jest tworzenie się prętów w siatkówce. Często występuje u ludzi (36 tysięcy przypadków jest rejestrowanych każdego roku), ale dla badań istnieje model pigmentowego zapalenia siatkówki u szczurów. Wiadomo było, że u szczurów choroba ta jest spowodowana jedną z dwóch mutacji w genie Pde6b (mutanty z zapaleniem siatkówki mają tę nazwę rd1) – albo mutacja punktowa Y347X, albo wirusowa wstawka Xmv-28, ale która z tych dwóch nie jest jasna. Zadanie wydaje się być takie: aby dowiedzieć się, która z tych dwóch mutacji powoduje utratę wzroku i czy jest to możliwe, poprzez usunięcie mutacji, w celu jej poprawy.

Na początek naukowcy stworzyli kombinację cząsteczek crRNA z Cas9, podczas gdy w sekwencji RNA przewidywano region z mutacją Y347X. Następnie skonstruowano cząsteczkę donora, oligonukleotyd, z normalnym, niezmutowanym, ukierunkowanym fragmentem. Cały ten kompleks przy użyciu plazmidów został wysłany do zapłodnionego jaja szczura z mutacjami zapalenia siatkówki. Założono, że crRNA-Cas9 będzie wycinał zmutowaną część DNA, a w międzyczasie normalny oligonukleotyd posłuży za podstawę do ukończenia wyciętego fragmentu (ryc. 8).

Ryc. 8 Schemat eksperymentu z mutacją Y347X: w eksonie zmutowanego genuPde6b (rd1) powinien ostatecznie zostać wstawiony do fragmentu nukleotydów TAT zamiast TAA; Aby to zrobić, część TAA musi być najpierw dokładnie wycięta, a następnie TAT musi być poprawnie zakończona. Zdjęcie z W.-H. Wu i wsp., 2016. Naprawa CRISPR ujawnia przedkliniczny model barwnikowego zapalenia siatkówki

Z tak traktowanych zygot wyrosły normalne szczury, w których testowały różne parametry funkcji wzrokowych. Ogólnie rzecz biorąc, leczenie zadziałało: u 7 z 11 zwierząt siatkówka wyglądała całkiem zdrowo (ryc. 9), liczba prętów była względnie normalna, a reakcje fizjologiczne na światło w siatkówce również powracały do ​​zdrowia. Co prawda, jak podkreślają naukowcy, w kilku przypadkach wskaźniki prawego i lewego oka różniły się. Oznacza to, że insercje i naprawy miały miejsce w mozaice, a nie tylko na etapie zygoty, ale później, kiedy miało miejsce tworzenie symetrycznych struktur zarodka.

Ryc. 9 Widok dna nerwu wzrokowego u zdrowych szczurów, u mutantówPde6b (rd1) i w utwardzeniu kompleksem crRNA-Cas9; normalne naczynia krwionośne i normalna siatkówka w pierwszym i ostatnim przypadku oraz struktury degeneracyjne w drugim są widoczne. Zdjęcie z W.-H. Wu i wsp., 2016. Naprawa CRISPR ujawnia przedkliniczny model barwnikowego zapalenia siatkówki

Autorzy wyciągnęli więc wniosek, że poprzez edycję zmutowanego genu możliwe było, po pierwsze,udowodnić, że u szczurów barwnik siatkówki wywołany jest mutacją punktową, a nie wstawką wirusową (pozostała niezmieniona u wyleczonych szczurów). Po drugie, i co najważniejsze, skutecznie koryguje wizualne funkcje mutantów. Rzeczywiście, u ludzi choroba ta jest spowodowana mutacją w podobnym genie.

Praca ta miała również kontynuację (patrz K. A. Schaefer i wsp., 2017. Nieoczekiwane mutacje po edycji CRISPR-Cas9 in vivo), która odzwierciedla postępujący proces naukowy zarówno w ogólnym, jak i pojedynczym laboratorium. Ta sama grupa sprawdziła, czy edycja CRISPR była bezpieczna dla zwierzęcia i czy miała niepożądane konsekwencje. Takie badanie jest w zasadzie konieczne, ponieważ każdy środek terapeutyczny nie powinien wywoływać poważnych skutków ubocznych. A jeśli leczy się zapalenie siatkówki, to tak, że w innych miejscach w genomie nie pojawiają się niepotrzebne mutacje. Ta kontrola trwała rok. W tym celu konieczne było przeprowadzenie pełnego sekwencjonowania DNA genomu u wyleczonych szczurów, a następnie porównanie macierzy uzyskanych mutacji z możliwymi mutacjami u dzikich i nieleczonych szczurów z linii mutantów. rd1. Unikalne mutacje, które wystąpiły tylko u wyleczonych szczurów i najprawdopodobniej będą to niechciane wyrostki robaczkowe.

Było zaskakująco wiele takich wyjątkowych mutacji, około półtora tysiąca.Spośród nich 1397 występuje w mutacjach punktowych i 117 w insercjach i delecji, które są około sto razy wyższe niż zwykłe tło mutacyjne. Uważa się, że dzięki działaniu crRNA-Cas9, jest bardziej prawdopodobne, że spodziewane są niepożądane insercje lub delecje. Ale obraz jest dokładnie przeciwny, większość mutacji punktowych. Liczby te oznaczają, że projekcje mutacji bocznych oparte na analizie bioinformatycznej mogą nie doceniać niektórych ważnych czynników. Dopóki metody oceny nie zostaną poprawione, lepiej jest polegać na sekwencjonowaniu całego genomu. Jest oczywiste, że metoda nadal wymaga udoskonalenia technicznego, chociaż jej potencjał terapeutyczny jest wyjątkowo wysoki.

Źródła:
1) Rodolphe Barrangou, Christophe Fremaux, Hélène Deveau, Melissa Richards, Patrick Boyaval, Sylvain Moineau, Dennis A. Romero, Philippe Horvath. CRISPR zapewnia nabytą oporność na wirusy prokariotyczne // Nauka. 2007. V. 315. P. 1709-1712. DOI: 10.1126 / science.1138140.
2) Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath. Dekada odkryć: funkcje i aplikacje CRISPR // Nature Microbiology. 2017. V. 2. Numer artykułu: 17092. DOI: 10,1038 / nmicrobiol.2017,92.
3) Wen-Hsuan Wu, Yi-Ting Tsai, Sally Justus, TingTing Lee, LiJuan Zhang, Chyuan-Sheng Lin, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan, Stephen H. Tsang. Naprawa CRISPR ujawnia przedkliniczny model retinitis pigmentosa // Terapia molekularna. 2016. V. 24. I. 8. P. 1388-1394. DOI: //dx.doi.org/10.1038/mt.2016.10.
4) Kellie A. Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F. Colgan, Stephen H. Tsang, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan. Nieoczekiwane mutacje po edycji CRISPR-Cas9 in vivo // Metody przyrodnicze. 2017. V. 14. P. 547-548. DOI: 10,1038 / nmet.4293.

Elena Naimark


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: