System CRISPR-CAS9 udało się sfotografować w akcji • Anastasia Pashutova • Wiadomości naukowe o "Elementach" • Biologia molekularna, genetyka

System CRISPR-CAS9 zdołał strzelać w akcji

Ryc. 1. Mechanizm systemu Crispr-Cas. 1 – segment DNA wirusa, który po raz pierwszy spotkał się z komórką (czerwony) jest wstawiony do locus CRISPR, gdzie segmenty DNA wirusów, które wcześniej napotkała komórka, są już przechowywane (kolorowe strzałki). 2 – na podstawie biblioteki CRISPR tworzone są przewodniki RNA, które tworzą kompleks z białkiem Cas (fioletowe owale). 3 – Kiedy kompleks Cas-RNA spotyka się z wirusowym DNA (zielony), komplementarny do przewodnika RNA, łączy się z nim i niszczy, krojąc na kawałki. Zdjęcie z gesundheitsindustrie-bw.de

Pomimo już ponad dziesięcioletniej historii studiowania systemu CRISPR-Cas i zastosowania go do edycji genomu, nikt dotąd nie oglądał go w pracy. Japońscy naukowcy wyeliminowali tę lukę i byli pierwszymi na świecie, którzy dostali wideo tego procesu za pomocą szybkiego mikroskopu sił atomowych. Okazało się, że elementy układu wiążą się z cząsteczkami DNA w inny sposób niż wcześniej sądzono: nie pełzają one wzdłuż tych cząsteczek w poszukiwaniu właściwego miejsca, ale znajdują je za pomocą dyfuzji trójwymiarowej.

System CRISPR-Cas9, który jest używany do edycji ukierunkowanej na genom, zyskał dużą popularność wśród naukowców.Liczba artykułów, które wymieniają ten system, rośnie z każdym rokiem (począwszy od kilku artykułów w 2011 r., A kończąc na ponad dwóch tysiącach artykułów w 2017 r.).

Przypomnijmy, że CRISPR-Cas jest układem odpornościowym bakterii. Podobnie jak nasz układ odpornościowy, który ma:
1) komórki pamięci, których zadaniem jest zapamiętanie "wroga" w twarz i zapisanie informacji o nim (na przykład, specjalna populacja limfocytów przechowuje informacje o wcześniej używanej broni przeciwko czynnikowi zakaźnemu i tworzy wtórną odpowiedź immunologiczną);
2) komórki, które będą bezpośrednio walczyć z wrogiem (na przykład zabójcy T);
bakterie mają również mechanizm mający na celu wyeliminowanie czynników zakaźnych. Tylko w bakteriach poszczególne komórki nie są odpowiedzialne za odporność, ale kwasy nukleinowe (DNA i RNA) i białka specjalnie przystosowane do tego celu. CRISPR (skupione regularnie przeplatane krótkie powtórzenia palindromiczne), kompleks powtarzalnych segmentów DNA, stanowi podstawę bakteryjnego układu odpornościowego. Pomiędzy nimi znajdują się przekładki – separatory z genomowymi fragmentami wirusów – genetyczne "portrety" tych, z którymi ta bakteria już się zetknęła. Jest to swoista baza identyfikatorów osób naruszających genom bakterii.

To działa tak.Jeśli wirus, którego wcześniej nie widziała i któremu udało się z nim walczyć, dostał się do bakterii, pozostawi w pamięci mały fragment wirusowego DNA, który będzie przechowywany w locus CRISPR (ryc. 1). Następnie konieczne jest przełożenie sekwencji nukleotydowej otrzymanej z wirusa na postać zdolną do kierowania białek Cas. W tym celu powstaje tak zwany przewodnik RNA (gRNA), który powtarza fragment wirusowego DNA wprowadzony do bazy. Z reguły przewodniki RNA tworzone są stale i przy dość niskiej prędkości, ale gdy komórka zderza się z wirusem lub w warunkach stresu, prędkość znacznie wzrasta. Po utworzeniu RNA wiąże się z kompleksem białek Cas. Teraz kompleks Cas-gRNA, podobnie jak policjant z identyfikatorem kryminalisty, może patrolować komórkę. Po znalezieniu fragmentu obcego DNA, który jest komplementarny do przewodnika RNA, kompleks wiąże się z tym fragmentem, a białka Cas rozszczepiają go jak parę molekularnych nożyczek. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego mechanizmu molekularnego, zobacz na przykład artykuł D.E. Dzhagarov, Smart Scissors for DNA.

Odkryta prawie 30 lat temu, przez ponad 20 lat, ten system był interesujący tylko dla biologów molekularnych, którzy próbowali zrozumieć właściwości tego unikalnego mechanizmu ochronnego.W 2012 roku potencjał systemów CRISPR-Cas9 został zidentyfikowany jako narzędzie do edycji genomu, który może inicjować ukierunkowane modyfikacje genetyczne w praktycznie dowolnym organizmie. W następnych latach, stosując tę ​​metodę, naukowcom udało się, na przykład, pozbyć się myszy chorób genetycznych (JR Mendell, LR Rodino-Klapac, 2016. Dystrofia mięśniowa Duchenne'a: ​​leczenie CRISPR / Cas9), aby wyleczyć zwierzęta z HIV (C. Yin i in., 2017. In Vivo Wycinanie pojedynczych przewodników RNA w modelach zwierzęcych, a nawet edycja genomów zarodka i dorosłego (patrz P. Liang i in., 2015. Edycja genów za pośrednictwem CRISPR / Cas9 w wielojądrowa ludzka zygota i popularna uwaga D. Cyranoski Chińscy naukowcy, którzy rozpoczęli pierwsze ludzkie badanie CRISPR). Przeczytaj historię i główne wyniki zastosowania tej metody w wiadomościach, podsumowano wyniki pierwszej dekady badania CRISPR ("Elementy", 13.07.2017).

Mimo znacznych postępów do dnia dzisiejszego nie zaobserwowano ani jednej bezpośredniej obserwacji funkcjonowania tego systemu. Luka ta została wyeliminowana przez grupę japońskich naukowców prowadzoną przez Mikihiro Shibatę (Mikihiro Shibata) za pomocą szybkiego mikroskopu sił atomowych (HS-AFM), który pozwala na obrazowanie cząsteczek, a nawet pojedynczych atomów. Artykuł o badaniu opublikowany w czasopiśmie Komunikacja przyrody.

Dzięki obrazowaniu HS-AFM dynamika białka może być utożsamiana z fantastycznymi szczegółami.Na przykład, wcześniej naukowcy, wśród których było kilka autorzy omawiane dzieło udało się naprawić Fotoindukowane zmiany konformacyjne w cząsteczce bakteriorodopsyna (M. Shibata et al., 2010. Szybki mikroskopia sił atomowych pokazuje dynamicznych procesów molekularnych w photoactivated bakteriorodopsyna) i obserwować cząsteczkę miozyny, filamenty aktyny spacerując (N. Kodera et al., 2010. obrazowania wideo chodzenia miozyny V o dużej prędkości mikroskopii sił atomowych).

Zasada działania z mikroskopu sił atomowych w oparciu o oddziaływanie międzycząsteczkowe pomiędzy powierzchnia próbki i sondy. Sonda jest krawędzią w nanoskali, która znajduje się na końcu elastycznego wspornika. Skanowanej powierzchni może przyciągać lub odpychać sondy, powodując wygięcie wspornika (rys. 2). Krzywizna ta jest rejestrowana za pomocą lasera, która jest odbijana od wspornika jest wprowadzane do wrażliwego fotodetektor (szczegóły – w artykule A. Patrz atomy Kuramshina dotknij cząsteczki). Szybka mikroskopia sił atomowych działa na tej samej zasadzie. Jedyną różnicą jest to, że używasz wspornika, który jest tysiące razy mniej niż stosowany w klasycznej AFM, który pozwala na zwiększenie szybkości akwizycji obrazu.

Ryc. 2 Schemat mikroskopu sił atomowych. Zdjęcie z simple.wikipedia.org

Naukowcy sami przygotowali niezbędne cząsteczki do badania. Białko Cas9 zsyntetyzowano w komórkach E. coli. E. colia następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej. Celowanie RNA i docelowy DNA zostały zsyntetyzowane in vitro. Ponadto przygotowano specjalny substrat, na którym następnie umieszczono biopolimery. Poniższe wymagania dotyczą substratów stosowanych w AFM: powierzchnia musi być wystarczająco gładka i dobrze adsorbować badane obiekty. Podczas skanowania biomolekuł najczęściej stosowano podłoża mikowe. I chociaż takie substraty mają hydrofilową powierzchnię z porcjami nawet atomowymi większymi niż 100 mikronów, mają kilka wad – na przykład, ujemny ładunek powierzchniowy (który może zakłócać DNA, ponieważ grupy fosforanowe również mają ładunek ujemny) i zdolność do tłumienia swobodnej dyfuzji kompleksy. Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, naukowcy zmienili powierzchnię miki na dwa różne sposoby:
1) potraktował powierzchnię miki roztworem APTES ((3-aminopropylo) trietoksysilanu), w wyniku czego na powierzchni miki uformował się film, który ma dodatni ładunek w wodzie.
2) utworzono dwuwarstwę lipidową na powierzchni miki, dzięki czemu zminimalizowano interakcje między kompleksem Cas9-RNA i miki.

Pierwszą rzeczą, jaką zrobili japońscy naukowcy, było sfotografowanie białka Cas9 bez kierowania RNA. Wcześniej, zmiany w białku Cas9, które wystąpiły podczas jego działania, badano za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej (PCA). Ta metoda pozwala na uzyskanie trójwymiarowej struktury cząsteczki, na przykład białka (patrz A. Oganow, 10 faktów dotyczących krystalografii). Krótko mówiąc, proces uzyskiwania obrazu za pomocą tej metody składa się z następujących etapów: sporządzenia nasyconego roztworu białka, który został poddany oczyszczeniu, procesu krystalizacji próbki, zbierania danych rozpraszania promieniowania rentgenowskiego i bezpośredniego przetwarzania danych, w tym symulacji komputerowych.

Wcześniejsze badania wykazały, że cząsteczka Cas9 w stanie wolnym ma sztywną strukturę. Aby to sprawdzić, japońscy naukowcy przyjęli modele kryształów uzyskane przez inną grupę badaczy i porównali je z obrazami uzyskanymi w AFM. Okazało się, że wolne białko ma ruchliwą strukturę, która różni się od sztywnej struktury obserwowanej w krysztale (ryc. 3, b, c).Oznacza to, że dane uzyskane wcześniej za pomocą XRD okazały się nieistotne, ponieważ nie odpowiadają strukturze białka w jego naturalnym stanie.

Ryc. 3 b– Struktury krystaliczne, od lewej do prawej: pojedynczy Cas9, kompleks Cas9-RNA, Cas9-RNA, połączony z jednoniciowym docelowym DNA i Cas9-RNA, połączony z jego celem (dwuniciowy DNA). Różne kolory wyznaczone funkcjonalne domeny białka: szary biały kawałek – ostrze alfa-spiralne, różowy – domena nukleazowa HNH, która rozszczepia cel DNA, niebieski – domena nukleazowa RuvC, która rozszczepia łańcuch niezwiązanego DNA, beżowy – Domena PAM rozpoznająca specjalny fragment docelowego DNA. c i d – obrazy sekwencyjne uzyskane za pomocą mikroskopu sił atomowych o wysokiej prędkości: pojedynczy Cas9 (c) i złożony Cas9-RNA ( d ). Wskazano mały ogon strzałkato kawałek RNA wystający z płatka alfa-spiralnego. Skale po prawej pokaż wysokość przedmiotu nad podłożem. Obraz z artykułu w dyskusji Komunikacja przyrody

Następnie naukowcy sfilmowali kompleks Cas9 z przewodnikiem RNA. W przeciwieństwie do pojedynczego białka, kompleks Cas9-RNA miał trwałą podwójną strukturę odpowiadającą strukturze krystalicznej (ryc. 3, b, d, patrztakże wideo nr 2 z materiałów dodatkowych do omawianego artykułu).

Kolejnym etapem była wizualizacja wiązania kompleksu Cas9-RNA z docelowym DNA. Na początku wszyscy "uczestnicy" zostali zaadsorbowani na powierzchni substratu: kompleksy cząsteczkowe Cas9-RNA i docelowe DNA. Na filmie widać, że kompleks Cas9-RNA wiąże się swoiście z jego docelowym DNA. Wszystko to przeprowadzono przy braku jonów magnezu Mg2+. Jony tego metalu są niezbędne do prawidłowego działania nukleaz, dlatego kompleks wiąże się z DNA bez magnezu, ale nie występuje już żadne rozszczepienie (ryc. 4, patrz także wideo nr 3 z dodatkowych materiałów do omawianego artykułu).

Ryc. 4 Kompleks Cas9-RNA, konkretnie (tj. W określonym miejscu, w którym nastąpi cięcie) związany z jego celem przy braku jonów Mg2+, nie przecina DNA. Obraz z artykułu w dyskusji Komunikacja przyrody

Aby unaocznić proces pękania DNA, naukowcy powtórzyli poprzedni krok, ale już dodali magnez. Następnie białko Cas9 było w stanie przeciąć DNA. Film pokazuje, jak po wstawieniu dwuniciowych pęknięć część DNA jest uwalniana z kompleksu (ryc. 5 i wideo).

Ryc. 5 Kompleks Cas9-RNA w obecności jonów Mg2+ tnie DNA. Białe i różowe strzałki wskazać domenę nukleazową NHN w stanie nieaktywnym i aktywnym. Pokazano koniec nici DNA. niebieska strzałka na ostatniej ramce. Obraz z artykułu w dyskusji Komunikacja przyrody

Kompleks Cas9-RNA przecina cząsteczkę DNA

Z powodu niewystarczającej rozdzielczości obrazów niestety nie wiadomo, w jaki sposób uwalnia się pozostała część cząsteczki DNA w kompleksie.

Naukowcom udało się także obalić teorię, jak dokładnie kompleks Cas9-RNA wiąże się z niezbędnym regionem w cząsteczce DNA: wcześniej sądzono, że białko związane z RNA "ślizga się" wzdłuż DNA w poszukiwaniu komplementarnego regionu. W tym celu naukowcy wykorzystali substrat oparty na bilipidzie, aby zminimalizować interakcję miki z białkiem, co może zakłócać swobodną dyfuzję kompleksu. Okazało się, że Cas9 bez przewodnika RNA wiąże się z cząsteczką DNA i po prostu ślizga się wzdłuż niej. Ale gdy białko ma RNA, który jest komplementarny do pożądanego miejsca, kompleks nie ślizga się, ale jest bezpośrednio związany z celem (ryc. 6, patrz także wideo nr 7 z dodatkowych materiałów do omawianego artykułu). Wydaje się, że obecność przewodnika RNA uniemożliwia kompleksowi Cas9-RNA "przeskoczenie" DNA w celu przesuwania się wzdłuż niego.Tak, że wiązanie występuje kosztem dyfuzji trójwymiarowej: pływać kompleksów w roztworze, i jeśli są szczęście, że obok żądanej sekwencji DNA, to wiążą się z nim.

Ryc. 6 a – kilka białek Cas9 (zaznaczone strzałki), które nie mają ukierunkowującego RNA, przesuwają się wzdłuż cząsteczki DNA. b – Complex cas9-RNA bezpośrednio wiąże się z żądanym miejscu, gdy jest blisko do niego ze względu na dyfuzję trójwymiarowej. Druga rama widać więcej cząsteczek DNA, z których jedna złożona Cas9 RNA już położony (dolna strzałka), z drugiej strony jest miejsce, z którym później skontaktuje się inny kompleks (górna strzałka). W czwartym i piątym klatek widać wyraźnie, że Cas9-RNA pojawia się w odpowiednim miejscu, ale nie od razu przesunąć na DNA. Obraz z artykułu w dyskusji Komunikacja przyrody

Te pozornie niepozorny granulowane i wideo zmuszając naukowców na całym świecie, dysząc z rozkoszy. Z jednej strony system CRISPR-Cas9 działa zgodnie z przewidywaniami wcześniej. Z drugiej strony, mamy ujawnił nowe szczegóły jak kompleks białko wiąże się z prawidłową sekwencję DNA. W ogóle, to badanie dostarcza niespotykane szczegóły funkcjonalnych dynamiki CRISPR-Cas9 i podkreśla potencjałszybka mikroskopia sił atomowych w celu określenia mechanizmów działania cząsteczek związanych z kwasami nukleinowymi.

Źródło: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, ​​Takayuki Uchihashi i Osamu Nureki. CRISPR-Cas9 real-space dynamika czasu rzeczywistego wizualizowana za pomocą mikroskopii sił atomowych o wysokiej prędkości // Komunikacja przyrody. 2017. DOI: 10.1038 / s41467-017-01466-8.

Anastasia Pashutova


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: