CRISPR / Cas przeciwko chorobie Huntingtona

CRISPR / Cas przeciwko chorobie Huntingtona

Tuyana Malankhanova, Suren Zakian
"Nauka z pierwszej ręki" №4 (75), 2017

Powyżej: "zdrowy" gen NTT kodujący białko huntingtynę. Poniżej: zmutowany gen HTT

Dzisiaj, zgodnie z Harvard Neuro Research Center, w samych Stanach Zjednoczonych około 5 milionów ludzi cierpi na chorobę Alzheimera; 1 milion – z choroby Parkinsona; 400 tysięcy – ze stwardnienia rozsianego; Po 30 tysięcy – od stwardnienia zanikowego bocznego (choroba Lou Gehriga) i choroby Huntingtona. Te zaburzenia, należące do grupy chorób neurodegeneracyjnych, są słabo poznane i nie istnieją skuteczne metody leczenia. Narzędzie do edycji genów, system CRISPR / Cas9, który jest aktywnie iz powodzeniem stosowany w biologii i medycynie, może pomóc rozwiązać ten problem.

O autorach

Tuyana Bairovna Malankhanova – Studia podyplomowe, Państwowy Uniwersytet Nowosybirski, Starszy Asystent Laboratorium, Laboratorium Rozwoju Epigenetycznego, Instytut Cytologii i Genetyki, Oddział Syberyjski Rosyjskiej Akademii Nauk (Nowosybirsk). Autor i współautor 3 artykułów naukowych i 1 monografii.

Suren Minasovich Zakian – Doktor nauk biologicznych, profesor, kierownik Laboratorium Rozwoju Epigenetyki Instytutu Cytologii i Genetyki,laboratorium komórek macierzystych Centrum Nowych Technologii Medycznych Instytutu Biologii Chemicznej i Medycyny Fundamentalnej Oddziału Syberyjskiego Rosyjskiej Akademii Nauk (Nowosybirsk); Laboratorium Medycyny Molekularnej i Komórkowej, Państwowe Centrum Badań Medycznych. Acad. E.N. Meshalkina (Nowosibirsk), Laboratorium Inżynierii Komórkowej FEN z Nowosybirskiego Uniwersytetu Państwowego. Autor i współautor ponad 200 artykułów naukowych, w tym 33 monografie i 5 patentów.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci średnia długość życia osoby wzrosła, a obecnie coraz więcej ludzi żyje w wieku, w którym zaczynają przejawiać się różne choroby związane ze starością. Takie "choroby starości" obejmują choroby neurodegeneracyjne, z których większość charakteryzuje się stopniową i selektywną śmiercią określonych typów komórek nerwowych. Przyczynami tych chorób są najczęściej naruszenia w genomie.

Rozważ ten problem za pomocą przykładu. Choroba Huntingtona (inne nazwy to zespół Huntingtona, pląsawica Huntingtona lub zespół Huntingtona) objawiające się objawami, takimi jak rosnąca utrata kontroli motorycznej i zaburzenia psychiczne.Pomimo faktu, że mutacja genetyczna powodująca tę chorobę została zidentyfikowana ponad 20 lat temu, molekularne mechanizmy jej rozwoju nadal nie są w pełni zrozumiałe, tak jak nie znaleziono skutecznego leczenia tej choroby.

Ludzie z chorobą Huntingtona mają nienormalne i niekontrolowane ruchy prawie wszystkich mięśni ciała ("taniec Świętego Wita"), a także upośledzenie umysłowe i poznawcze. Ta poważna choroba zwykle zaczyna objawiać się po 35 latach i ma charakter progresywny.

Modelowanie choroby

Przyczyną choroby Huntingtona jest wzrost liczby powtórzeń trójnukleotydowych CAG w genie HTT kodującym białko polowanie. Normalnie ten gen zawiera od 8 do 36 powtórzeń, ale kiedy liczba ta osiąga 37 lub więcej, choroba zaczyna się rozwijać. Potrójny CAG koduje aminokwas glutamina. W związku z tym, w chorobie Huntingtona huntingtyna jest syntetyzowana z wydłużonym łańcuchem poliglutaminowym. Takie białko ma nieregularną strukturę przestrzenną i nie może spełniać swojej funkcji w komórkach, które, nawiasem mówiąc, są wciąż nieznane. Ponadto w prążkowieW jednej z części mózgu, które regulują napięcie mięśni, zmutowane białko tworzy agregaty, które mają efekt toksyczny. W tym przypadku ciężkość przebiegu choroby zależy od liczby powtórzeń CAG.

Aby zbadać procesy molekularne, które prowadzą do rozwoju patologii, a także do testowania nowych leków, potrzebujemy modelu biologicznego, który możliwie jak najdokładniej powtarza ludzką chorobę. Aby stworzyć model choroby Huntingtona, naukowcy wprowadzili zmutowany ludzki gen NTT do genomu myszy laboratoryjnych. Jednak wyniki uzyskane w takich "mysich" modelach nie zawsze dokładnie odzwierciedlają procesy zachodzące w ludzkim ciele. Wyjdź – linie komórkowe pochodzące od ludzi.

Aby zbadać chorobę Huntingtona, konieczne jest posiadanie komórek prążkowia, ale trudno jest uzyskać taki biomateriał. Ten problem został rozwiązany przez indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPSC), które można dość łatwo przeprogramować, można uzyskać z ludzkich komórek skóry lub krwi. Ponadto, komórki te można ekspandować w nieograniczonych ilościach i różnicować (przekształcenie) w prawie każdy pożądany typ komórki.

System edycji genomu CRISPR / Cas9 jest obecnie używany do tworzenia linii komórkowych modelujących chorobę Huntingtona poprzez wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich komórek somatycznych.

Zwykle podczas modelowania chorób stosuje się komórki od chorych osób, a jako kontrolę od zdrowego dawcy. Jednak ze względu na obecność w ludzkim genomie ogromnej liczby pojedynczego nukleotydu polimorfizmy takie pary komórek nie są całkowicie poprawne do porównania. Idealną kontrolą dla "chorych" komórek byłyby komórki z dokładnie tym samym genomem, ale bez mutacji powodującej chorobę. Takie komórki są nazywane pary izogeniczne lub przez linie. Aby utworzyć linie izogeniczne i użyć narzędzia do edycji genów CRISPR / Cas9.

Poznawanie środowiska genów

Chociaż choroba Huntingtona jest choroba monogenowatj. z powodu mutacji w jednym genie znane jest ponad 100 tak zwanych genów modyfikujących, które mogą wpływać na czas pierwszych objawów, nasilenie choroby itp. GeCKO oparte na CRISPR / Cas9 (Shalem i wsp., 2014).Umożliwia tworzenie całych bibliotek docelowych genów dla CRISPR / Cas9 i wyłączenie tysięcy genów w zaledwie kilku krokach. W ten sposób można wyprodukować w krótkim czasie nokaut (wyłącz) wszystkie geny modyfikujące i dowiedz się, w jaki sposób wpływa to na żywotność komórek, szybkość ich dzielenia itp.

Przy pomocy narzędzi opartych na CRISPR / Cas9 możesz teraz edytować nie tylko genom, czyli informacje dziedziczne, ale także epigenomeco odzwierciedla zmiany w pracy genów, które nie wpływają na strukturę DNA. Dzięki edycji genomu mamy możliwość zmiany poziomu ekspresji genów docelowych. Aby to zrobić, opracowano już narzędzia, które wykorzystują "wyłączony" Cas9, przyłączony do niego różne enzymy zdolne do aktywacji lub, przeciwnie, do hamowania poziomu produkcji jednego lub drugiego białka. Na przykład w przypadku choroby Huntingtona możliwe jest specyficzne hamowanie syntezy zmutowanego białka, co zapobiega tworzeniu się agregatów białkowych i śmierci neuronów prążkowia.

Można jednak aktywować i związki, które przyczynią się do przyspieszonego usuwania lub degradacji białek o niewłaściwej strukturze.Na przykład efekt ten osiąga się dzięki aktywacji białek szoku cieplnego (chaperony), które przywiązują znaki śmierci do nieprawidłowych białek. Białka oznaczane w ten sposób wchodzą w specjalne struktury komórkowe, gdzie ulegają zniszczeniu.

Ponadto, narzędzia do modyfikacji epigenomu oparte na CRISPR / Cas9 mogą zmieniać poziom syntezy białka przez modyfikację chromatyna – kompaktowy kompleks DNA, RNA i białek w chromosomach. Możesz wprowadzić takie modyfikacje chromatyny, co doprowadzi do bardziej "luźnego" fałdowania DNA, które aktywuje transkrypcja (odczyt informacji genetycznej na RNA). Inne modyfikacje, wręcz przeciwnie, mogą przyczyniać się do bardziej zwartego zwijania DNA i spowolnienia lub nawet całkowitego zablokowania transkrypcji.

Traktujemy?

CRISPR / Cas9 można również stosować w leczeniu choroby Huntingtona. Istnieją dwie opcje ekspozycji: skracanie powtórzeń CAG lub wyłączenie zmutowanej kopii genu.

W pierwszym przypadku, użycie dwupasmowych pęknięć CRISPR / Cas9 jest wstawiane w sekwencję z powtórzeniami. Jednak ta interwencja ma odwrotny skutek – wzrost liczby powtórzeń CAG. Problem został rozwiązany za pomocą nikaz Cas9 – zmutowane białka Cas9, które powodują pękanie pojedynczych nici w DNA. Eksperyment wykazał, że kolejne pęknięcia pojedynczej nici w regionach, w których w najgorszym przypadku występują powtórzenia, nie zmieniają długości przekroju z powtórzeniami, a co najwyżej prowadzą do oczekiwanego skrócenia (Cinesi i in., 2016).

Schemat skracania wydłużonego odcinka powtórzeń genu HTT CAG przy użyciu standardowego systemu CRISPR / Cas9, który wprowadza DNA dwuniciowe do DNA i przy użyciu nikaku Cas9, który wprowadza jednoniciowe przerwy. Przekroje: (Cinesi i in., 2016)

Możesz użyć tej strategii, aby wyłączyć gen w tych rzadkich przypadkach, gdy występują pojedyncze nukleotydowe różnice między dwiema kopiami genu NTT. Jeżeli takie polimorfizmy znajdują się po obu stronach miejsca z nieregularnymi powtórzeniami, mogą być użyte jako cele dla nożyczek CRISPR / Cas9. Jednocześnie nie wpłynie to na normalną kopię genu (Shin i wsp., 2016).

Badania nad chorobą Huntingtona za pomocą systemu CRISPR / Cas9 są obecnie prowadzone w Rosji. Tak więc, w laboratorium rozwoju epigenetycznego Instytutu Cytologii i Genetyki Oddziału Syberyjskiego Rosyjskiej Akademii Nauk (Nowosybirsk), trwają prace nad otrzymaniem izogenicznych linii komórek macierzystych, które modelują chorobę Huntingtona poprzez wprowadzenie wydłużonych szlaków CAG do normalnego genu NTT, jak również różnicowanie iPSC w neurony prążkowia.W przyszłości naukowcy z Nowosybirska planują przejść do badania roli genów modyfikujących w patogenezie tej choroby za pomocą modelu komórkowego.

Istnieje powód, by mieć nadzieję, że wyniki badań doprowadzą do stworzenia skutecznej metody leczenia. Ponadto mogą one pomóc w badaniu innych chorób neurodegeneracyjnych, których rozwój wynika z podobnej mutacji.

Literatura
1. Miedwiediew S.P. Jak edytować dziedziczność // Nauka z pierwszej ręki. 2014. T. 55. Nr 1. P. 10-14.
2. Cinesi C., Aeschbach L., Yang B., Dion V. Kontrakty CAG / CTG powielane przy użyciu nickazy CRISPR-Cas9 // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 13272-13281.
3. Shalem O., Sanjana N. E., Hartenian E. i in. Skanowanie nokautu CRISPR-Cas9 w skali genomu w komórkach ludzkich // Nauka. 2014. V. 343. N. 6166. P. 84-87.
4. Shin J. W., Kim K.-H., Chao M. J., i in. Trwała inaktywacja specyficznej dla allelu mutacji CRISPR / Cas9 przez chorobę Huntingtona // Hum Mol. Genet. 2016. V. 25. N. 20. P. 4566-4576.


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: